폐선암의 특징을 NGS를 통해 알아보자

　

　

  폐암은 산업화에 따른 대기오염, 흡연자의 증가 등으로 인해 최근 그 발생률이 증가하면서, 사람들의 관심 또한 커지고 있다. 특히 폐암은 우리나라 암환자의 사망률 1위를 차지하고 있는 만큼 건강에 관심이 많은 현대인들에게 나이와 성별을 불문하고 가장 관심을 받는 질환으로 떠오르고 있다. 경제수준이 낮아 먹고 살아가는 것이 가장 중요했던 과거에는 그 발병률 또한 낮아 사람들의 관심을 크게 받지 못하였으나, 최근 의학의 발달로 인한 정확한 진단이 가능해짐과 대기오염, 담배의 대중화 등으로 그 발병률은 꾸준히 증가함을 보이고 있다.

  전 세계적으로 폐암으로 사망하는 인구는 연간 130만 명에 육박하며, 이 중 40%가 폐선암(Lung Adenocarcinoma)으로 연간 50만 명 이상의 사망자를 낳고 있다. 폐선암은 폐암의 한 종류로 말초 기관지 벽에서 발육하여 혈행성 전이를 가져오는 경우가 많다. 조기 발견하면, 절제 수술로 가능한 경우도 있으나, 모든 암이 그렇듯이 발견이 늦어지면 사망 확률 또한 높아져 평균 5년 생존률이 15%에 불과하다.

폐선암 환자의 유전체 해독

　

  이에 케임브릿지에 있는 하버드, MIT 브로드 공동연구소에서는 폐선암 환자 183명의 DNA를 엑솜시퀀싱(exome sequencing)하여 체세포의 변이 속도를 측정하고 발암 유전자U2AF1, RBM10, ARID1A의 변이를 확인하여, 이를 기반으로 특정 돌연변이를 분석하여 폐선암 타겟 치료에 이용하였다. 흡연 기간과 유전자 변이에 따른 엑손 내 EGFR, SIK2 kinase의 rearrangement 또한 확인하였다.

  183명 폐선암 환자의 임상적 특징을 나타낸 것으로, 흡연 유형 4가지(비흡연자 27명, 매년 10갑 미만 피는 118명, 매년 10갑 이상 피는 17명, 알 수 없는 21명)와 종양 4단계(1단계 90명, 2단계 36명, 3단계 22명, 4단계 10명, 알 수 없는 25명)으로 분류하였다.

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  whole exome sequencing(WES)와 whole genome sequencing(WGS) 통계 결과이다. 실험은 159명은 WES, 23명은 WGS과 WES, 1명은 WGS을 하였다. 엑솜시퀀싱은 94배수로 진행하였으며 SNP array로 copy number variation(CNV)를 감지하였다. 또한 체세포의 적은 수의 Indel을 확인한 결과, 43,813개 missense 변이, 14,801개 slient 변이, 3,504개 nonsense 변이, 1,460개 절단 부위, 2,310개 결실과 839개 삽입, 11,009개 그 외 변이를 발견했다. 또한 WGS와 WES에 의해 감지된 변이를 비교하여 돌연변이 진화를 확인하는 과정에서 69개의 후보 변이를 선택하여 참조 유전체 해독(resequencing)을 수행하였다.

  폐선암 환자의 체세포 돌연변이가 증가하는 것을 확인하기 위해, 스펙트럼 분석으로비흡연자와 흡연자의 종양 돌연변이 발생 속도를 비교 관찰한 것이다. 특정 엑손영역에서의 돌연변이 비율에 따라 183명을 클러스터링한 것으로 5가지 변이 스펙트럼으로 나눈 것이다. 클러스터1에서는 T/CpG 변이가 드물게 나타났으며, 담배를 적게 피는 흡연자에게서 주로 나타났다. 클러스터2에서는 T/CpG 변이와 교차형 염기전이인 transversion이 나타났으며, 클러스터3에서는 C/A 변이가 추가로 나타나는 희귀 돌연변이가 보였다. 클러스터4에서는 C/T변이가 나타났고, 클러스터5에서는 종양 돌연변이의 비율이 높게 나타났다.

   C->A(CpG->T)변이에 대한 예측과 확인된 것을 비교하여 환자의 임상적 특징과의 연관성을 확인하였다. 흡연 상태에 따라 최대 75%의 DNA 손상 차이를 보이고 있으며, 이를 통해 금연의 중요성 또한 확인할 수 있었다.

높은 희귀 암의 분석과 새로운 폐선암 유전자 예측

　

  폐선암 환자들 중 5명에게서 적어도 하나의 nonsynonymous 체세포 변이가 발견되었다. 이는 TTN, CSMD3, LRP1B 유전자 변이로, 각각의 특징은 다음과 같다. TTN은 유전체 내 유전자의 footprint에 위치하며, CSMD3는 발현 정도가 낮으며, LRP1B는 silent mutation라는 특징이 있다.

  폐선암의 체세포 돌연변이를 보여주는 것으로 PPH2 및 LOF InVEx 분석한 결과이다. 분석 결과, 폐선암으로 발현된 변이 또는 하나 이상의 다른 종양은 암 유전자의 증폭에 의해 일어난 것이었다.

  Nonsynonymous 변이 세 가지에 대해 나타내고 있는데, A는 U2AF1 유전자로 101번 염기가 C에서 T로 변경되었으며, 아미노산은 세린에서 페닐알라닌으로 변경되었다. 이는 주로 myelodysplastic 증후군(MDS; 골수이형성증후군)을 유발하며, 종양 세포를 증폭하거나 KRAS 유전자를 활성화 시키기도 한다. B는 RBM10유전자로, Frameshift나 splice-site 변이에 의한 폐선암을 유발하는 oncogene이다. C는 ARID1A 유전자로 염색체의 구조에 frameshift Indel 변이를 유발한다.

  엑손 영역 내의 체세포 번이를 나타내며, non-silent 변이 수에 따라 배열한 것이다. 각 환자의 흡연 상태와 변이 스펙트럼 클러스터를 나타낸 것이고, 하단은 SNP array 데이터에서 파생된 체세포 CNV를 나타낸 것이다.

전장유전체 해독에서 새로운 구조변이를 발견

　

  24명의 전장 유전체 시퀀싱한 것이고, 2,349개 체세포 1,818개 염색체 내 재정렬과 531개 염색체 간 재정렬을 확인하였다. 25개 유전자의 유전적 재정렬 유형을 나타내고, CDKN2A, STK11, EGFR과 새로 발견된 MAST2, SIK2, ROCK1 유전자를 Circos plot으로 나타냈다. Circos plot은 복잡한 유전자 데이터를 시각화하는 Perl 기반 어플리케이션으로 원형으로 시각화 시킨 것이다. 분석 결과, 염색체 구조의 3%가 보존되어 있다는 사실을 알 수 있었다.

  또한 CDKN2A는 동형 유전자 돌연변이의 결실(ROCK1) 및 메틸레이션과 역배열 융합(C9orf53-CDKN2A)이 일어났다. EGFR은 엑손 25, 26번이 결실되었으며 PIK3C2B, CBL가 상호작용하고, 719번의 글라이신이 세린으로 변하는 체세포 변이를 포함한다. SIK2는 175번, 15번 트레오닌이 발현하여, ROS1-CD74 단백질을 translation하며, 융합과 Indel 등의 변이를 포함한다.

  EGFR유전자에서 구조 내 결실을 확인 한 것으로,  염색체 C 말단 부위의 결실과 EGFR 변이를 비교한 것이다. NIH 3T3 세포의 발현을 분석하여 엑손 25, 26번 번이로 인해 결실된 것을 확인한 것이고, C는 EGF 단백질의 부재에서 엑손 영역에서 결실로 인해, EGFR과 AKT 유전자의 인산화가 증가한 것을 보여준 것이다. erlotinib 치료에 의해 EGFR 유전자 결실 돌연변이에 의한 세포 성장이 낮아진 것을 보여준다.

맺음말

　

  이번 연구에서 폐선암을 유도하는 유전자 변이 25개중 19개는 이전에 보고된 것과 동일함을확인하였고, 새로운 변이 6개 SNV를 확인하였다. 폐선암의 차세대 Hallmark를 나타낸 것으로 폐선암의 체세포 변이를 추정할 수 있다. 폐선암의 경우, 암 유발 유전자 변이는 47%이고, 하나 이상의 세포를 증폭하는 신호 유전자가 55%에 달하였으며, 이를 통해 면역 파괴와 종양, 염증을 피할 수 있는 자료를 알아보았다.

  이번 연구는 폐선암을 대상으로 NGS 기법을 이용한 대규모 해독 및 분석으로, 분석을 위해 체세포 변이 유전자 식별에 최근 발표된 통계법이 이용되었다. 또한 연구 결과는 NGS 등 최신 연구방법을 통해 종양에 대한 이해 수준을 높임으로써, 치명적 질환에 대한 임상적 개선에 활용될 것으로 기대된다.

참고문헌

　

Mapping the Hallmarks of Lung Adenocarcinoma with Massively Parallel Sequencing

http://www.cell.com/retrieve/pii/S0092867412010616

Sequence analysis of mutations and translocations across breast cancer subtypes.

http://www.nature.com/nature/journal/v486/n7403/full/nature11154.html

The Cancer Cell Line Encyclopedia enables predictive modelling of anticancer drug sensitivity.

http://www.nature.com/nature/journal/v483/n7391/full/nature11003.html

저자

　

글 : Park.HyeonJi

편집 : Lee.SeungYoun

키워드 : 폐선암, whole genome sequencing, whole exome sequencing, copy number variation, single nucleotide variation, Hallmark, SNP array, erlotinib, InVEx 등