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급성 출혈성 발열과 관련된 Rhabdovirus 유전체 해독
[그림1] Rhabdovirus에 감염된 나뭇잎
급성 출혈성 발열과 관련된 바이러스
바이러스 출혈성 열병은 산발적으로 순환계에 영향을 끼치는 질병으로 개발 도상국에서 흔히 발생한다. 출혈 열병의 질병 원인체가 인체 내에서 짧은 잠복기를 거쳐 갑작스런 발병을 일으키고, 빠른 진행속도를 보이며 높은 사망을 나타낸다. RNA 바이러스로는 오직 네 가지(Arenaviridae, Bunyaviridae, Filoviridae 및 Flaviviridae)만이 인수공통 감염성이 있다고 알려져 왔다. Arenaviridae는 아프리카에서 매년 50만건의 치명적으로 발생하는 Lassa 바이러스이며, 리프트밸리 열병 바이러스가 포함된 Bunyaviridae는 아프리카 남쪽에서 주로 발생한다. 에볼라와 마르부르크 바이러스가 속한 Filoviridae는 중앙 아프리카에서 높은 사망률을 일으키는 원숭이와 사람 공통 감염 바이러스이다. 황열병1)과 뎅기열2) 바이러스가 속한 Flaviviridae는 사하라 사막 이남의 아프리카 전역에 분포하는 바이러스이다.
Mononegavirales에 속하는 Rhabdovirus3) 중 사람에게 병원성이 있는 것은 주로 광견병 바이러스로 알려져 있다. 그러나 Rhabdovirus가 광견병이 아닌 급성 출혈성 발열 증상을 보이는 인간 감염을 보여서 화제가 되고 있다. 아프리카 콩코 민주 공화국에서는 급성 출혈성 열병 발생의 2,009건 중에서 3건의 Rhabdovirus에 감염된 사람을 발견하였다. 3주간 잠복해 있다가 3일 이내에 갑작스런 발병이 이루어져서 높은 발열과 점막출혈을 일으키다가 두 명의 환자는 결국 사망하였다.
바스 콩코 바이러스(BASV; Bas-Congo virus)는 생존자의 급성 혈청 샘플에서 추출되어 드노보 시퀀싱(De novo sequencing)이 되었다. 또한 계통 분석을 하여 바스 콩고 바이러스가 rhabdovirus와 유사한 아미노산 서열을 가지고 있음이 확인되었고, 인간에게 전송되는 경로를 추측할 수 있게 되었다. 이번 연구로 인해 바스 콩고 바이러스는 아프리카에서 급성 출혈성 발열을 일으키는 새로운 인간 병원체로 밝혀졌다.
바이러스 드노보 시퀀싱(De novo sequencing)
캘리포니아 대학의 바이오 메디컬 연구소에서 급성 출혈성 열병으로 사망한 이들의 부모에게 동의를 구하고 혈청 샘플을 얻었다. 또한 아프리카 각 지역에서 원인을 알 수 없는 출혈성 발열을 일으킨 사람들에게서 혈액을 기증받아 혈청만을 분리했고, 분리한 혈청에서 바스 콩고 바이러스 항체를 검사했다. RNA는 QIAamp viral RNA mini kit (Qiagen)를 이용하여 추출되었고, Taqman RT-PCR4) 검사를 하였다. 급성 출혈성 발열 증상을 일으키는 바이러스에 대해서도 유전체 분석을 진행하였다.
본 연구는 바스 콩고 바이러스에 감염되어 급성 출혈성 열병을 일으켰다고 추정되는 15살 소년과 13살 소녀, 그리고 보건센터에 근무하던 32살 남성 간호사를 대상으로 연구하였다. 15살 소년은 Mangala 마을의 보건 센터에 제출된 자료에 의하면 설사와 발열, 호흡기 출혈로 2일만에 사망했다. 13살 소녀의 경우 15살 소년과 같은 학교에 다니는 여학생으로 같은 지역에 거주하고 있었다. 그러나 환자1과 달리 두통, 발열, 복통, 코피, 결막염, 구강출혈, 빈혈, 혈변 등의 심각한 증상을 보여 말라리아 항생제를 투여 받았으나, 발병 4일째에 사망했다. 두 환자를 간호하던 보건센터 간호사였던 32살 남성은 출혈성 증상 후 거식증, 두통, 피로감, 복통, 발열을 보였으나 항생제 치료와 지역 종합병원의 치료로 며칠 후 회복증세를 보였다.
마르부르크 바이러스(MARV; Marburg virus, 4종의 에볼라 바이러스(Ebola virus; Zaire(ZEBOV), Sudan(SEBOV), Coˆte d’Ivoire(CIEBOV), Bundibugyo(BEBOV), Crimean-Congo hemorrhagic fever virus(CCHFV), 황열 바이러스(YFV; Yellow fever virus), 뎅기 바이러스(DENV; Dengue virus), 리프트밸리열 바이러스(RVFV; Rift Valley fever virus), 치군군야 바이러스(CHIKV; Chikungunya virus)에 대해서 로슈 454 시퀀싱 플랫폼을 이용하여 pyrosequencing5)을 진행하여 220bp씩 읽어 바이러스 단백질 시퀀스를 확인하였다. GenBank를 이용하여 rhabdoviruses와의 서열 비교를 통해 조립하였다. 또한 바스 콩고 바이러스 유전체는 추가적으로 일루미나 HiSeq2000으로 시퀀싱하였다. 드노보 어셈블리를 통해 98.2%를 완성한 후 100bp씩 읽어 BLASTn 또는 BLASTx로 조립하였다. 140억bp의 양을 SOAP와 BLAT 소프트웨어를 이용하여 분류하고 BLAST를 사용하여 분석하였다.
Rhabdoviruses 종과 비교하여 BASV의 계통 분류
바스 콩고 바이러스는 크게는 dimarhabdoviridae 그룹에 속하였지만, Trbrogaragan, Ephemerovirus 그룹과는 같은 뿌리였지만 분화된 특징을 보였다. 25~33.7%의 매우 낮은 아미노산 유사성을 관찰할 수 있었다. 바스 콩고 바이러스는 다른 바이러스들과는 다르게 다섯 가지 핵심 유전자 사이에 더 복잡한 유전체를 보여, 인간의 병원균에서도 상당히 분화된 결과를 보였다. 그 중에서도 Tibrogargan와는 U1, U2, U3의 유전자가 유사하여 다른 그룹보다 유사성이 높았고, Ephemerovirus 그룹에 속하는 소 유행성 열 바이러스는 바스 콩고 바이러스와 달리 유전자가 위치하는 3가지 부위에서 차이를 보였다.
또한 2008년에서 2010년까지 원인이 불분명한 출혈성 열병이 발생한 사람들에게서 기증받은 혈청 샘플 43개에서는 바스 콩고 바이러스가 감지되지 않았다. 또한 콩고 민주 공화국에서 기증받은 지역 특이성 혈장 샘플로 검사를 하였으나, 역시나 바스 콩고 바이러스는 감지되지 않았다. 같은 지역에 거주했던 세 사람 중 두 사람은 사망하고 한 사람은 생존한 원인을 생존자에게서 찾으려 시작했던 연구는, 생존자의 다른 바이러스성 병원체에 대한 항체 존재로 인해 회복되었다는 결론을 얻게 되었다.
맺음말
본 연구에서 감염경로에 대한 추측은 물 또는 공기, 동물이나 가축에 잠재적인 노출이 원인이라고 여겼다. 그 이유는 가장 유사한 그룹인 Tibrogargan, Ephemerovirus는 소와 버팔로를 통해 감염되는 경로를 가졌고 rhabdoviruses 종의 계통 구조상, 가장 유력하기 때문이다. Moussa virus의 경우 말라리아 모기에 의해 감염이 되기도 하기 때문에, 바스 콩고 바이러스의 감염 경로에 대해서는 현재까지도 다각도로 연구가 진행 중이다. 또한 사망한 환자들을 간호하며 접촉했던 보건소 직원 중 출혈성 발열 증상을 보이지 않은 직원뿐 아니라 감염 경로에 관련된 인물들에 대해서도, 바이러스 병원균의 감염 가상 모델을 적용하여 연구 중에 있다.
Rhabdoviridae는 전 세계적으로 분포되어 있으나 열대지역에 많이 분포하는 성향을 보인다. 이에 우리나라도 기온의 상승으로 열대지역이 될 가능성을 두고, 임상 및 공중 보건적 차원에서 Rhabdoviridae에 대해서 조사할 필요가 있다. 그런 점에서 이번 연구는 종을 분류하고 감염경로를 역추적하는 일에 유전체 분석이 큰 역할을 한 사례가 되었다. 유전체 분석을 통해 새로 발견된 병원체의 가능성이 더 큰 인간의 발병을 예측하고, 이를 대비하기 위한 예방책으로 사용될 것이다.
- 황열병 : 황열은 아프리카와 남아메리카 지역에서 유행하는 바이러스에 의한 출혈열이다. 질병을 일으키는 바이러스는 아르보 바이러스(arbovirus)로 모기에 의해 전파된다. 따라서 이 바이러스를 전파시킬 수 있는 모기의 서식지가 주요 황열 발병 지역과 일치한다. 이 병에 걸린 환자의 일부에서 황달로 인해 피부가 누렇게 변하는 증상이 나타나기 때문에 황열(yellow fever)이라고 부르게 되었다.
- 뎅기열 : 뎅기열은 뎅기 바이러스가 사람에게 감염되어 생기는 병으로 고열을 동반하는 급성 열성 질환이다. 뎅기 바이러스를 가지고 있는 모기가 사람을 무는 과정에서 전파된다. 이 모기는 아시아, 남태평양 지역, 아프리카, 아메리카 대륙의 열대지방과 아열대지방에 분포한다. 우리나라에는 없는 병이지만, 최근에는 유행지역에 다녀온 후 발병하는 경우가 매년 30여 명씩 보고되고 있다. 뎅기 바이러스를 전파하는 모기는 집 주위에 서식하는 모기이며, 보통 비가 고인 폐 타이어나 물웅덩이에 서식하고, 주로 낮에 활동한다.
- Rhabdovirus : 바이러스입자는 60×80nm 로가늘고 길며 한쪽 끝이 편평한 탄환상이고, 피막 안쪽에 나선상(외경 18nm, 내경 10nm, pitch 7.5nm)의 뉴클레오캡시드를 함유한다. 게놈은 11,000~12,000 염기 길이의 외가닥 RNA, RNA 중합효소를 함유하며 감염 직후의 바이러스mRNA합성에 관여한다. 적혈구응집능력, 용혈능력은 없다. 세포질 내에서 증식하며 특유의 봉입체, 즉 네그리소체(Negri body)를 형성한다.
- RT-PCR(Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction) : mRNA에 대해 PCR을 적용하기 위한 방법. PCR에서 Taq DNA중합효소는 RNA에는 작용하지 않으므로 RNA사슬의 PCR을 하려면 먼저 cDNA를 제작해야 한다. 즉, 역전사 효소와 올리고(dT) 시발체를 사용하여 역전사 반응을 전 단계로서 시행한다. rT-PCR은 유전자발현, 즉 mRNA가 발현하고 있는 지를 검색할 뿐 아니라 mRNA의 정량도 가능하다. 정량한 mRNA의 cDNA를 매개체에 이입시킨 후, T7 RNA중합효소를 사용하여 RNA화해서 농도정량의 기준으로 사용하면 높은 감도로 신속, 정확하게 정량 할 수 있다.
- Pyrosequencing : DNA를 합성하는 동안 생성되는 부산물인 Pyrophosphate(PPi)를 이용한 기술로 Enzyme cascade(효소연쇄반응)를 응용, Pyrosequencing중 나타나는 빛을 CCD 카메라로 검출하여 데이터화한다.
참고문헌
A Novel Rhabdovirus Associated with Acute Hemorrhagic Fever in Central Africa
http://www.plospathogens.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.ppat.1002924 MrBayes 3.2:
Efficient Bayesian Phylogenetic Inference and Model Choice Across a Large Model Space.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22357727
Vaccines against viral hemorrhagic fevers: non-human primate models.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21445006
저자
글 : hjpark
편집 : Thkim
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키워드 : rhabdoviruse, pyrosequencing, HiSeq2000, 바스 콩고 바이러스(BASV, Bas-Congo virus), 급성출혈성 발열, De novo sequencing 등
