From 재단법인 게놈연구재단

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HIV-1 수용체의 친화성을 4가지 플랫폼의 NGS로 확인

 

  수백만 년에 이르는 인류역사에서 전염병은 언제나 공포의 대상이었다. 치료법은 커녕 원인도 알 수 없는 질병이 출현해 이 마을, 저 마을 휩쓸고 다닐 때마다 인류는 멸망할지도 모른다는 공포를 느껴야 했다. 중세말기에 유행한 페스트(흑사병; Plague, 페스트균이 일으키는 급성 전염병)나 제1차 세계대전이 끝날 무렵 유럽을 강타한 독감이 그 예다. 에드워드 제너(Edward Jenner)에 의해 종두법으로 전염병 예방의 가능성을 확인하고, 루이 파스퇴르(Louis Pasteur)에 의해 백신이 개발되면서 인류는 서서히 전염병의 공포에서 벗어날 수 있게 되었다. 그러나 인류의 문명과 의학이 발전할수록 새로운 전염병이 발견되는 속도도 빨라지고 있다. 인류는 자신을 위협하는 미생물과 언제 끝날지 모르는 전쟁을 벌여야 하는 상황이다.

 

  그 중에서도 인체면역결핍 바이러스(HIV•human immunodeficiency virus)가 1983년 발견되어, 에이즈(AIDS; acquired immune deficiency syndrome)를 유발한다는 사실을 확인하였다. HIV에 감염되어 걸리는 에이즈는 후천성 면역결핍증으로 수혈이나 정액, 모유 등의 체액으로 감염되는데, 감염된 사람과의 성관계, 감염된 혈액의 수혈, 모유로 인한 태아감염과 임신 중 모체에서 태아로의 감염이 주 경로이다.

 

  이 병에 걸리면 해로운 물질이나 미생물이 몸 속에 침입했을 때 방어에 필요한 면역기능이 약화되어 해를 입게 된다. HIV가 피 속의 면역기능을 담당하는 T세포를 파괴하여, 면역기능이 결핍되기까지는 수개월에서 수년 정도의 시간이 필요하기 때문에, HIV에 감염이 되면 ‘바이러스 보균자’가 되며, 면역결핍이 진행되면 ‘에이즈 환자’가 되는 것이다. HIV 감염만으로 사망에 이르지는 않고, 면역기능이 결핍되어 이차적으로 발생한 질병에 의해 사망하게 된다. 이러한 HIV는 감염원에 따라 2가지로 구분된다. HIV-1은 침팬지, HIV-2는 아프리카 검댕원숭이로부터 나왔다. 그래서 HIV-2는 사하라 사막 일부 지역에 주로 분포하고 있지만, HIV-1은 전세계적으로 널리 분포하고 있고 감염력과 독성이 더 강하다.

 

  감염력과 독성이 강한 HIV-1는 전세계에 널리 퍼진 환자들의 특성상, 여러 지역에서 연구가 진행되고 있으며, NGS의 발달로 더욱더 활발하게 진행 중이다. 본 연구는 영국 멘체스터 대학의 진화생물학과 연구진들이 HIV-1 수용체의 친화성을 4가지 NGS 플랫폼을 이용하여 확인한 것으로, 바이러스 전체를 볼 수 있었던 Roche의 454 플랫폼만을 이용했던 예전과 달리, 정확도를 높여 출시된 다른 기기(PacBio, Illumina, Ion Torrent)와의 성능 비교를 하였다.

 

 

HIV-1 수용체, CXCR4와 CCR5

 

  HIV-1의 감염은 숙주세포에 흡착하면서 시작되는데, 이 때 표면단백질의 모양이 결정적인 영향을 끼친다. 지금까지 이러한 HIV-1 수용체로는 CXCR4(X형)와 CCR5(R형)가 관찰되었으며, 초기에는 CCR5 수용체를 이용한 HIV 약물로는 매라바이록(maraviroc)과 셀센트리(Celsentri)가 개발되었다. 그러나 시간이 흐르면서 바이러스에 내성이 생겼고, 매라바이록이 CXCR4 수용체에 변이가 발생하여 내성을 가지게 된 환자들이 생겨났다. 그래서 약물치료를 받고 있는 환자들의 HIV-1의 염기서열 중 가장 변화가 심한 V3지역을 관찰하여, 약제 내성과 흡착 수용체의 변화를 확인하였다.


  R형 변이의 확산을 확인하기 위해 스페인 카를로스 III 병원에서 HIV-1 환자 12명의 RNA를 수집하였다. HIV-1 환자 12명의 정보를 통해, 8명이 R형 변이가 있었고, 그 중 5명이 매라바이록 약물에 내성이 있었다.

 

  또한 HIV-1 치료를 위해 매라바이록을 사용한 유럽인 환자 105명의 V3지역(337bp)의 amplicon을 수집하여, 454와 PacBio로 분석하였다. 플랫폼에서 읽는 길이에 따라, Illumina와 Ion Torrent는 좀더 작은 길이(150~200bp)에 적합했다. 그러나 표면의 당 단백질 gp120과 gp41에 위치한 V3 지역은 4가지 플랫폼 모두에서 읽을 수 있었다.

 

 

4가지 NGS 플랫폼으로 HIV-1 V3 지역의 염기서열 비교


  gp120과 gp41 단백질 암호화 지역을 PCR하여 염기서열을 DNA STAR Laser gene 소프트웨어(v.7.1.0)로 분석하였으며, 변이 지역인 env 지역의 V3를 4가지 NGS 플랫폼을 사용하여 deep sequencing 하였다.

 

  12명의 환자 샘플 별 NGS 플랫폼에 따른 read(V3 지역)의 Indel을 비교한 것이다. Roche 454는 V3 지역을 포함한 337NT(nucleotide) 조각을 PCR하고, 454 GS-FLX 플랫폼으로 pyrosequencing하였고, Illumina는 2,302NT 조각을 Illumina GAIIx(Genome Analyzer IIx)로 분석하였다. 또 Pacific Biosciences는 RS 플랫폼으로 V3 지역을 포함한 env 유전자 전체(2830NT)를 PCR하고, Roche 454처럼 337NT 조각을 해독하였다. Ion Torrent는 2,302NT 조각을 Ion Xpress로 라이브러리 제작하여, PGM(personal genome machine) 플랫폼을 이용하여 314칩에 로딩하여 해독하였다.

  

  NGS 플랫폼 별 변이 빈도를 비교하고, 샘플의 변이를 클러스터링하여 계통나무를 나타낸 것(GraphPad prism)이다. 플랫폼에 따라 PCR 오류 비율이 다르며, 증폭에 따른 변이 감지 비율도 다르게 나타났다.

 

 

HIV-1 수용체의 친화성 비교

 

   HIV-1 수용체의 친화성(tropism)을 결정하는 네 가지 NGS 플랫폼을 비교한 것이다. deep sequencing과 genotyping에서 HIV-1 수용체가 검출된 10 샘플의 친화성을 비교 분석한 결과, R형 수용체 변이로 인한 친화성이 8 샘플에서 감지되었으며, 나머지 2 샘플에서는 X형 수용체 변이가 감지되었다. 분석은 Geno2Pheno를 이용하여 3.5%와 10% FPR(false positive rates) 범위에서 확인하였다. 또 웹 PSSM를 이용하여 플라즈마 샘플에서 R형 수용체 변이를 확인하였다.

 

  세포의 감염력을 결정하기 위해 재조합 바이러스를 생성하는 과정에서 Trofile 분석(ESTA)이 이용되기도 하였으나, 높은 비용과 긴 처리시간과 같은 실질적 한계가 있었다. 그리하여 개발된Geno2Pheno는 HIV-1 수용체의 친화성을 평가하기 위한 분석 방법으로 사용되었다. 이 방법은 유전형만 분석하면 바이러스 변이의 20%만 감지되기 때문에, 표현형과 같이 분석하는 특징이 있다. 또한 NGS를 이용하여 R형 변이를 검출하는 감도를 향상시켰다.

 

 

맺음말

 

  4개의 NGS 플랫폼에 의해 염기서열의 변화를 비교하고, Geno2Pheno와 웹 PSSM을 이용하여, 시퀀싱(70%)만으로 비교 분석하는 것과 기존의 분석 방법인 Trofile(80%)에 비해 감도가 향상되었다. 또한 HIV-1 수용체 친화성을 이용하여, 표면 당 단백질의 변이를 미리 예측하여 약물의 조제에도 영향을 끼쳐 효과적인 치료에 도움이 될 것이다.

 

  이처럼, NGS는 동식물과 미생물 전장 유전체 시퀀싱부터 유전질환과 암에 관련된 다양한 연구에 이용되고 있다. HIV 연구에는 지금까지 454 플랫폼이 많이 연구되어 왔으나, 최근 NGS 기기들의 발전으로 각 플랫폼 별 read 길이와 오류 비율, 시간, 비용 등 장단점이 측정되고 있다. PCR 증폭에서 454는 오류비율이 0.1~0.5%로 낮은 반면, 독특한 바이러스 변이 서열을 확인하는 감지율은 PGM이 높게 나타났다. 또, Illumina의 genotyping 결과에서는 조류 독감 바이러스나 대장균 변이의 배열까지도 확인이 가능했다.

 

  다양한 NGS 플랫폼에는 그에 맞는 다양한 생명정보학 알고리즘이 있으며, 약간의 차이가 존재한다. 연구 목적에 맞는 NGS 플랫폼을 이용하면, 더 나은 결과를 얻을 수 있을 것이다.

 

 

참고문헌

 

Use of Four Next-Generation Sequencing Platforms to Determine HIV-1 Coreceptor Tropism

http://www.plosone.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pone.0049602

Ultra-deep sequencing of HIV-1 reverse transcriptase before start of an NNRTI-based regimen in treatment-naive patients.

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0042682212000189

Study of genotypic and phenotypic HIV-1 dynamics of integrase mutations during raltegravir treatment: a refined analysis by ultra-deep 454 pyrosequencing.

http://connection.ebscohost.com/c/articles/74614623/study-genotypic-phenotypic-hiv-1-dynamics-integrase-mutations-during-raltegravir-treatment-refined-analysis-by-ultra-deep-454-pyrosequencing

 

 

저자

 

글 : Park.HyeonJi

편집 : Park.SinGi

키워드 : 인체면역결핍 바이러스(HIV•human immunodeficiency virus), 에이즈(AIDS; acquired immune deficiency syndrome), PacBio RS, Illumina, Genome Analyzer IIx Ion Torrent, PGM, 454 GS-FLX, deep sequencing 등