Notice04 Rheumatoid arthritis

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류마티스 관절염도 유전적 치료가 가능하다

  암이나 백혈병과 같은 난치병에 걸리면 사람들은 절망에 빠지기 쉽다. 불치병이 아님에도 죽음 등의 부정적인 생각으로 병세가 더욱 악화되거나 우울증 등의 정신질환까지 동반돼 치료가 더욱 어려워지는 경우가 많다.

　　

  류마티스 관절염(RA; rheumatoid arthritis)도 마찬가지다. 류마티스 관절염은 국가에서 인정한 희귀 난치성 질환으로 많은 사람들이 진단 후 절망에 빠져 제대로 된 치료를 받지 못하고 있다. 하지만, 류마티스 관절염은 불치병이 아니며, 치료법이 없는 것도 아니다. 다만 치료가 길고 항상 조심해야 하는 질환이기 때문에 생활습관의 수정이 필요하다. 휴식 및 스트레스 관리에 철저해야 하는 류마티스 관절염은 면역력 저하로 발생할 수 있는 ‘자가면역질환’이다. 자가면역질환이란, 면역체계의 비정상적인 활동으로 외부의 세균으로부터 우리 몸을 지키는 면역세포가 자신의 인체를 공격해 발생하는 질환을 말한다. 때문에 불면증으로 양질의 숙면을 취하지 못하거나 과도한 스트레스를 받는 것은 면역력을 저하시킬 수 있다.


  또 류마티스 관절염은 다발성 관절염을 특징으로 하는 원인 불명의 질환으로, 면역체계를 통한 역추정 연구가 진행될 뿐이었다. 이전의 연구에서 죽음의 수용체라 불리는 DR3와 IL6 프로모터의 메틸레이션에 의한 IL10의 발현으로 면역세포의 이상이 발생하는 사실을 밝혀냈다. 이번 연구에서는IL10에 대해 유전자 분석을 진행하여, IL10의 발현에 영향을 끼치는 사이토카인과 CpG 메틸레이션, 그리고 phospho-CREB(cyclic AMP response element-binding) 단백질의 DNA와의 결합 상호작용에 대해 밝혀내었고, 류마티스 관절염의 새로운 치료 전략을 세울 수 있도록 정보를 제공하였다.


  류마티스 관절염에 관련된 IL10이 발현하는 데 사이토카인1)이 중요한 역할을 한다. 사이토카인은 염증 억제와 면역반응을 조절하는 화학물질 신호로 CpG 메틸레이션2)과 CREB 단백질의 DNA 결합에 의해 영향을 받는다. 사이토카인의 생산을 조절하는 메커니즘을 이용하여 IL10의 발현을 조절하겠다는 목적으로 수행되었다. 사이토카인은 단핵세포, Th2 세포, Treg 세포에 의해 생산되어 염증을 억제하고, B세포의 성장과 분화에 기여하지만, T세포는 증식을 억제하는 등의 면역 반응을 조절한다. 사이토카인은 TNFα, IL1β, IL6, 타인과 같은 염증성 사이토카인의 생산을 조절하거나 사이토카인 억제제의 생산을 자극하여 생산을 조절할 수 있다.



류마티스 관절염의 CpG methylation 연구

　

  류마티스 관절염의 질병 경로에 관여하는 IL10과 사이토카인의 발현에서 CpG 메틸레이션과 CREB 단백질의 DNA 결합을 감지하기 위해, ChIP-Seq과 pyrosequencing을 수행하였다.


  연구는 류마티스 관절염 환자 20명과 컨트롤 20명의 말초혈액 단핵세포를 추출하여, 5μmol/L의 5 azacytidine3)(DNA 발현 억제제)의 유무에 따라 배양하였다. 실험에 참여한 사람들은 30~40대 남성 4명, 여성 16명으로 골관절 질환이 가장 많이 발생하는 나이대의 환자들로, 체내 호르몬으로 인한 여성의 빈도가 높은 것을 반영하여 선별하였다. 또한 추가로 진행된 실험에서는 생물정보학 분석을 위해 사람, 짧은 꼬리 원숭이, 쥐의 IL10 loci를 비교하였다. 그 결과 75% 이상의 독립적인 서열을 보였다.


  CpG 메틸레이션을 감지하기 위해 페놀-클로로포름 방법을 이용하였고, PSQ(Post-starburst Quasar) 분석 설계 소프트웨어 (Biotage, 스웨덴)을 이용하여 분석하였다. ChIP-Seq은 말초혈액 단핵세포에서 사이토카인에 결합하는 phospho-CREB를 감지하기 위해, antiphospho-CREB(Ser133)로 수행되었고, SPSS 소프트웨어(v 14.0)을 이용하여 통계적 분석을 하였다.


  그 결과, 환자와 컨트롤 모두에서 355, 385, 387bp에서 높은 메틸레이션을 보였으나, 145bp에서는 대조적으로 환자에서만 높은 메틸레이션을 보였다. IL10을 발현시키는 사이토카인에 phospho-CREB가 결합하여 과발현이 일어나게 되었기 때문이다. 이처럼 CpG 메틸레이션은 류마티스 관절염의 유전자 전사를 조절하는 데 중요한 역할을 하였다.


  IL10에서 CRE(cyclic AMP response element)를 생물정보학 방법(rVISTA; 웹 기반 소프트웨어)으로 확인하였다. 특정 전사 인자에 대한 종간의 보존 서열을 식별해주는 방법으로 인트론 1부터 4까지 원숭이와 인간 사이의 보존 서열을 확인하여, 그 중 세 부위가 5’에 까까운 부위, 발현 및 인트론 1~4, 종간 보존 CRE 부위이다. 종간의 서열이 보존되는 것은 IL10의 발현 조절에 중요한 영향을 끼친다.



류마티스 관절염의 mRNA 발현 연구

　

  또한 메틸레이션 위치와 mRNA 발현을 확인하였다. TNFα mRNA 발현은 컨트롤에 비해 류마티스 관절염 환자의 말초혈액 단핵세포에서 많이 나타났다. CpG 메틸레이션 부위에 5 azaC를 처리한 것과 처리하지 않은 것에서 발현을 확인한 것이다.


  mRNA 및 단백질 β와 TNFα이 지속적으로 유지되어 메틸레이션의 위치를 확인하는 pyrosequencing4)의 결과이다. [Figure 1의 A]는 pyrosequencing 결과에서 145bp에서 류마티스 관절염 환자와 컨트롤의 차이를 보였다. 샘플을 독립적인 t 테스트를 통해 메틸레이션된 CpG를 IL10 프로모터에서 확인한 결과로, 환자와 컨트롤간의 차이를 보였다.


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　　　　　　　　　　　　　　　　　　Figure 2 145bp에서 환자와 컨트롤의 mRNA 발현 비교


  [Figure 2]는 환자와 컨트롤의 IL10의 145bp CpG 메틸레이션에서 mRNA 발현을 비교한 것이다. 특히, [Figure 2의 A]는 1, 2, 3은 환자이고 4, 5, 6은 컨트롤로 β 액틴은 차이가 없었으나, IL10에서는 환자에서 많이 발현되었다. [Figure 2의 B와 C]는 145bp에서 류마티스 관절염 환자가 mRNA와 단백질이 더 많이 발현된다는 것을 보여준다.


  환자의 샘플에 5-azaC로 치료 유무에 따른 IL10 프로모터와 업스트림 프로모터 지역 내에 phospho-CREB를 ChIP 분석을 한 결과이다. 부위별 치료 유무를 비교한 그래프로 5-azaC에 의해 DNA 합성이 저해되어, 시토신에 phospho-CREB가 결합하지 못하고 IL10으로 발현되지 않았다.



류마티스 관절염 증상 완화제


  류마티스 관절염 환자의 임상적 치료를 통한 개선은 불안정하여, 유전자 요법이 시도되었고, 질병경로에 죽음 수용체인 DR3와 IL6를 발현시키는 T세포 유전체, 광범위한 메틸레이션이 감지되었다. IL10의 발현에 사이토카인과 CREB 단백질의 신호경로를 유전자 분석을 통해 알아내었고, 발현이 높은 인간과 쥐는 서열이 보존되어 145bp에서 메틸레이션의 차이를 보였다. 단핵 세포, B세포, Th2세포, Treg세포에 의해 IL10의 생산이 일어나는데, 이를 조절하여 mRNA 발현을 높이면 류마티스 관절염의 증상을 완화시킬 수 있다.


  류마티스 관절염을 치료하기 위해 기존에 사용해 오던 글루코코디코이드(glucocorticoids)5)는, 히스톤의 디아세틸레이션으로 DNA를 응축시켜 단백질의 결합이 이루어지지 않게 한다. 이와 비슷하게 5 azaC는 DNA 메틸레이션을 억제하여 IL10에서 전사되는 mRNA의 디메틸레이션을 유도한다. 또한 사이토카인에 결합하는 phospho-CREB에 CREB, ATF-C, EBPβ-DNA 화합물과 대신 결합하게 하는 비경쟁적 저해제로 작용하여 5 azaC와 같은 기능을 한다. 이와 비슷하게 CREB 단백질 옆에 결합하여 사이토카인에 결합하지 않도록 하는 STAT3, NF-KB, GRE 등은 IL10의 발현에 간접적으로 관여하기도 한다.


맺음말

　

 이처럼 류마티스 관절염은 유전적 변이를 발견하는 것 만으로도 증상의 완화가 가능하다. 불치가 아닌 난치이며, 그러한 어려움도 유전체 분석을 통해 확인 및 치료가 가능한 것이다. 유전적 변이 위치를 발견하고 개개인 별 다른 위치의 메틸레이션을 확인하여, 맞춤형 타겟 치료가 가능해지면 류마티스 관절염은 더 이상 난치성 질환이 아니다. 유전체 해독 기술의 발전으로 메틸레이션 감수성이 높아지면, 더욱더 정교하고 세밀한 치료가 가능해 질 것이다.




  1. 사이토카인 : 신체의 방어체계를 제어하고 자극하는 신호물질로 사용되는 당단백질이며, 펩타이드 중 하나
  2. CpG 메틸레이션 : C(cytocine; 시토신)과 G(guanine; 구아닌)에 메틸기(CH3)가 붙는 현상.
  3. 5 azacytidine : C8H12N4O5. 분자량 244.14. 녹는점 230~234℃. Streptoverticillus lakadamus var.가 생산하는 피리미딘 항생물질. 주로 그람 음성균에 유효하며, 항암성도 있고, 생체 내에서는 인산화되어 핵산에 편입되고 DNA합성을 저해한다.
  4. Pyrosequencing : DNA를 합성하는 동안 생성되는 부산물인 Pyrophosphate(PPi)를 이용한 기술로 Enzyme cascade(효소연쇄반응)를 응용, Pyrosequencing 중 나타나는 빛을 CCD 카메라로 검출하여 데이터화
  5. 글루코코디코이드(glucocorticoids) : 부신 피질에서 분비되는 스테로이드 호르몬



참고자료

　

Hypomethylation of proximal CpG motif of interleukin-10 promoter regulates its expression in human rheumatoid arthritis

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21986577

Characterization of a rare IL-10-competent B-cell subset in humans that parallels mouse regulatory B10 cells.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20962324

Cyclic AMP response element-binding protein is implicated in IL-6 production from arthritic synovial cells.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19921094


저자

　

글 : hjpark

편집 : Thkim

키워드 : ChIP-Seq, IL10, IL6, 사이토카인(cytokine), CpG methylation, phospho-CREB, CRE, 류마티스관절염, 글루코코디코이드 등

　

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