게놈 해독을 통한 미토콘드리아 질병의 분자 진단

　　

  미토콘드리아로 인해서 발생하는 질병들은 16.6kb의 미토콘드리아 게놈과 약 1,500개의 단백질을 발현시키는 nuclear 게놈이 연관된 복잡한 질병이라고 할 수 있다. 모계 유전을 따르는 미토콘드리아 질병의 확실한 진단을 위해서는, 다양한 생화학, 분자 생물학적 접근이 필요하다. 그리고 이러한 방법으로 확인된 병인 후보 유전자들을 생어시퀀싱(Sanger sequencing)을 통하여 하나씩 재확인 한다.

　

  그러나, 차세대 유전체 시퀀싱(Next Generation Sequencing; NGS)의 개발은 진단 과정을 혁신적으로 바꾸었다. 대규모 병렬 시퀀싱(Massively parallel sequencing; MPS)를 이용한 분석은 미토콘드리아 게놈 전체에 있는 Point mutation과 deletion을 하나의 과정으로 추려낼 수 있기 때문이다. 뿐만 아니라 NGS는 그룹화된 유전자들이나 엑솜(exome) 전체를 동시에 분석 가능하기 때문에 질병의 원인이 되는 유전자들을 하나의 과정을 통해서 확인할 수 있다. 그러므로 이 새로운 방법은 보다 더 효율적이고 신속하게 유전자 분석을 가능케 한다. NGS을 통해 뿜어져 나오는 방대한 양의 데이터들은 생정보학 (Bioinformatics)을 통한 분석과 새로운 변이 (Novel variant)의 해석에 새로운 숙제를 안겨 주었다.

　

  핵 내 유전자 몇 개 그룹은 잘 알려진 몇 개의 미토콘드리아 증후군에 연관이 있는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, 미토콘드리아 DNA의 발현에 관련된 유전자들은 간뇌변성과 근질환의 형태를 포함한 mtDNA depletion syndrome을 발생시킬 수 있으며, 호흡 반응(Respiratory chain complex)과 관련된 유전자의 경우, 결핍증을 유발할 수 있다. 이 밖에도 미토콘드리아 단백질 발현의 장애로부터 유래되는 많은 병증들이 있으므로 통합적인 분자생물학적 진단은 미토콘드리아 질병에 연관이 있는 핵 내 유전자들의 분석을 포함해야만 할 것이다.

　

　　

차세대 시퀀싱 기술과 모계 유전의 미토콘드리아 DNA 질환의 통상적 진단

　

  NGS는 타겟 유전자의 농축과 라이브러리 준비 그리고 대용량 시퀀싱을 통해 처리량을 높여 지원한다. 타겟 유전자 농축의 목적은 원하는 유전자의 단백질 발현 영역의 선택적 농축에 있다. 보통 농축 방법의 선택은 분석할 유전자의 숫자와 크기 그리고 전체 목표 사이즈에 따라 결정된다. 예를 들어, 분석할 유전자의 전체 타겟 사이즈가 수백 kb 정도라면 PCR이나 multiplex PCR 방법이 적당할 것이나, PCR은 최적화를 시키기 어렵고 전체 타겟 사이즈가 방대할 경우, PCR을 위한 프라이머를 합성하는 것이 실용적이지 못할 것이다.

  통상적으로 모계 유전의 미토콘드리아 DNA 질환이 의심되는 환자의 경우 RFLP(Restriction fragment length polymorphism)과 ASO(allele specific oligonucleotide) dot blot hybridization 같은 PCR 실험 방법을 이용한 흔한 pint mutation을 검색하는 방법을 사용한다. 하지만 이러한 방법은 이후 확인이 필수적이며 몇몇 알려진 point mutation만 발견이 가능하다는 단점이 있다. 만약 알려진 점변이 (point mutation)들이 발견되지 않은 경우나 모계유전이 확실시 않을 경우에는 생어시퀀싱을 이용한 미토콘드리아 게놈 전체의 해독이 이루어진다. 그러나 이 방법 역시 20% 이하의 이형적 돌연변이(heteroplasmic mutation)를 발견하기에는 감수성이 부족하다는 단점이 있다. 뿐만 아니라 PCR primer 부착 영역의 시퀀싱 불가 문제 또한 빼놓을 수 없는 단점이다.

　

　

NGS 기반의 미토콘드리아 게놈 전체의 비교분석

　

  최근부터 새로 개발된 NGS 기술이 임상 진단의 방법으로 사용되기 시작했다. 미토콘드리아 게놈은 전체 사이즈가 비교적 작고 인트론을 포함하고 있지 않기 때문에, PCR이나 LR-PCR(long range PCR)이 농축의 방법으로 자주 이용된다. 그러나 다수의 프라이머 쌍을 이용한 방법은 위에서 언급한 단점들을 포함하고 있다. 대체적인 방법으로서는 RNA나 DNA 프로브를 이용한 캡쳐 방법이 있으나 시퀀싱 데이터에서 큰 구간의 DNA 삭제나 heteroplasmic variant을 발견하는 것은 사실상 불가능하다.

　

  이러한 단점들을 보완하기 위해 한 쌍의 프라이머만을 이용한 LR-PCR이 미토콘드리아 게놈의 단일 앰플리콘(amplicon)을 생성시키기 위해 사용된다. 여기에 사용되는 프라이머는 mtSNP (미토콘드리아 단일변이)의 빈도수가 최소라고 알려져 있는 non-coding D-loop 영역에서 선택된다. 미토콘드리아 게놈이 농축된 이후에는 454, SOLid, Affymetrix re-sequencing chip, Illumina, IonTorrent 등에서 제공되는 방법에 따라 라이브러리가 제작된다.

　

  미토콘드리아 게놈 전체가 하나의 엠플리콘으로 제작되기 때문에, 모든 염기 쌍이 초기의 게놈에서 발현되는 비율을 나타낸다고 가정할 수 있다. 그리고 DNA 삭제 영역의 발견 또한 가능하다. 그러나, DNA 삭제 영역이 포함된 경우 그것들의 이형성이 과대 평가될 가능성은 존재한다. 그러므로 mitochondrial reference sequence(rCRS)에 대응이 되지 않은 염기배열을 판단할 시에는 덜 엄중한 한도를 사용하여 삭제의 중단점을 정확하게 판단하는 것이 중요하다.

　

  이형적 돌연변이의 정확한 측정은 결과의 해석과 유전적 상담할 때 중요하게 작용한다. 그러므로 NGS를 통한 DNA 삭제 측정과 임상진단으로서의 사용은 다수의 연구를 바탕으로 진행이 되어야 한다.

　

　

NGS에 의한 타겟 유전자 분석

　

  타겟 유전자들은 통상적으로 용액 내의 프로브의 혼성화(hybridization)를 이용하여 확인된다. 그러나 앞서 언급한 바와 같이 크기가 큰 유전자나 다수의 유전자일 경우 PCR 방법의 한계점이 드러난다. 미토콘드리아 관련 질병의 임상 진단을 위한 NGS 방법은 적은 수의 유전자에서 엑솜 전체에 이르는 범위까지 다양하게 존재한다. 어떤 NGS 방법을 사용할 지는 생화학, 분자생물학적 실험결과와 병리조직학적 이미지 결과, 대략의 비용, 가족력 등에 의해 결정이 된다.

　

  mtDNA depletion syndrome 같은 잘 알려진 질환을 판단하기 위해서는 NGS 기반의 유전자 분석이 가장 적당하며, 임상적 사용을 위해 이미 최적화 되어있다. 일반적으로 small NGS panel은 전체 타겟 유전자의 전체 엑솜을 충분한 depth(500-1,000X)로 해독하고, 불충분한 경우(<20X) PCR과 생어시퀀싱을 통하여 채워진다. 그러므로 small NGS panel을 이용한 방법은 평균 depth가 50-100X 정도인 전체 엑솜 시퀀싱과는 차별적이나 전체 Mitome (미토콘드리아체) 의 1-10% 정도이거나 전체 엑솜이나 전체 게놈의 1% 미만의 양만 분석이 가능하다는 단점이 있다.

　

  WES (전엑솜해독)와 WGS(전게놈해독)는 많은 유전자를 결과로 포함하고 있기 때문에, 결과 전체의 확인이 용이하지 않다. 때문에 불충분하게 확인된 단백질 발현 영역은 주로 결과에서 제외된다. 그러므로 false negative rate이 결정 되어지지 않고 다수의 부수적인 결과와 새로운 이형들이 임상의들의 유전적 상담과 진단에 추가적인 복잡성을 야기한다는 단점이 있다.

　

　

새로운 변이에 대한 이해

　

  핵 내 유전자 서열의 임상학적 중요성은 ACMG (American College of Medical Genetics and Genomics) 권고사항에 따라 결정되고 발표된다. 가이드라인은 mtDNA를 해석하는 데에도 사용되는데 mtDNA 돌연변이의 특성, 유전방법 그리고 조직특이성 등이 추가로 고려된다. 새로 발견된 유전자의 기능적 연구는 시간이 많이 소모되기 때문에, 발견되는 모든 유전자를 검사하는 것은 사실상 불가능하다. 아래의 컴퓨터 모의예측 알고리즘은 missense와 splice site를 예상하는데 사용된다.

　

  mtDNA 이형을 분석하는 데는 모계유전, 조직특이성, 한계점 등이 포함 되어야 한다. 이 모든 정보들은 정확한 유전적 상담과 진단을 할 때 매우 중요하게 작용하기 때문이다. 예를 들어 발견된 돌연변이의 가족적 위험도를 판단하기 위해서는, 그 돌연변이가 de novo 발생인지 유전적 변이 인지를 판단하는 것이 가장 중요하다. 즉, mtDNA 돌연변이가 근육조직에서만 발견이 되었다면 그것은 근육조직 특유의 체세포 돌연변이일 가능성이 큰 것과 같다.

　

　

맺음말

　

  NGS 데이터를 통한 미토콘드리아 DNA 관련 질환의 분석과 진단의 임상학적 활용은 이미 외국에서는 실현이 되었다. 다수의 실험들이 CLIA (Clinical La. Improvement Ammendments) 와 CAP 법률에 완전히 입증된 NGS 기반의 유전자 검사를 제공하고 있다. NGS 기반의 검사에는 수백 개의 유전자에서 엑솜 전체를 포함하는 다양한 방법이 있다. 임상학적 검사로 사용하기 전에, 먼저 유전자의 포함 범위가 넓어질수록 실험적 오류와 유전자 발견 한계점이 명확히 규명되어야 할 것이다.

　

　

참고문헌

　

Next Generation Molecular Diagnosis of Mitochondrial Disorders

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S156772491300024X

Monogenic mitochondrial disorders.

http://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMra1012478

Human mitochondrial DNA: roles of inherited and somatic mutations.

http://www.readcube.com/articles/10.1038/nrg3275

　

　

저자

　

글 : Son.BongJun

편집 : Jong.Bhak, Park.HyeonJi

키워드 : NGS, MPS, mtDNA, de novo, point mutation, mitochondria 등