HiSeq2500으로 50시간 내에 이루어진 신생아의 유전자 질병 진단

태아 유전체 해독?

  지난 6월 미국 워싱턴대학 연구팀이 연구한, 엄마 혈액만으로 태아게놈(유전정보)를 해독이 가능하다는 연구 결과가 과학저널 사이언스(Science)에 발표되었다. 이 기술을 활용하면 아이가 태어나기 전에 다운증후군, 낭포섬유증 등 유전자 이상에 의한 유전 질환에 걸렸는지 미리 알 수 있고, 치료까지 가능할 것으로 의학계는 보고 있다.

  지금까지 알려진 유전질환은 약 3,000여가지로, 전 세계 신생아 100명 중 1명은 이런 질환을 안고 태어난다. 이에 따른 지난 연구로 임신부의 혈액 속 DNA 가운데 최대 10%는 태아의 것이라는 사실을 발견하고, 그 결과가 98%이상 일치한다는 사실을 밝혀냈다. 그러나 이런 연구로 인해 우성의 유전자를 가진 아이만 낳고 그렇지 않은 아이는 낙태하는 식으로 심각한 윤리 문제가 발생할 수 있어서 바로 상용화하는 것은 힘들 것으로 보인다.

  그러나, 태아와는 다르게 신생아의 경우는 다르다. 현재 미국에서 유아 사망의 20% 이상이 선천성 기형, 변형 및 유전 질환을 일으키는 염색체 이상에 의해 발생한다. 3,528가지 단일 유전자 변이로 인한 질병에서 확인된 원인 변이들은 초기 28일의 진단이 중요하다. 빠른 진단으로 질병률 및 사망률을 낮출 수 있을 뿐만 아니라, 부모에게 부적절한 희망을 심거나 불필요한 죄책감을 주는 것을 막을 수 있다. 이와 관련하여, 본 연구는 태아가 아닌 신생아를 대상으로 유전자 질병을 진단하여, 성인이 되어 발병할 수 있는 질병의 원인을 조기에 감지하였고, 그 결과 질병의 치료시기를 조절할 수 있게 되었다.

  신생아들은 단일 유전자 변이로 인한 질환은 진행 속도가 매우 빨라서, 자동화된 생물정보학적 분석 도구를 보유하고 치료에 집중적으로 사용해야 한다. 그러나 신생아들의 질병 분자 진단에 대한 정보가 많지 않고, 빠른 시간에 진단할 방법이 현재로서는 없었다. 이에 일루미나(Illumina)에서 새로이 선보인 HiSeq2500 시퀀싱 플랫폼으로 전장 유전체 시퀀싱을 수행한 결과, 50시간 내에 신생아의 유전자 질병을 진단할 수 있었다.

신생아 유전체 해독!

  캔사스 시티의 어린이 병원(Children’s Mercy Hospital; CMH)에서 부모로부터 동의를 얻은 이란성 쌍둥이(UDT002, UDT173)와 가족들에게서 채취한 샘플과, 같은 병원에 있는 유전자 질환을 앓고 있던 네 명의 신생아(CMH064, CMH076, CMH172, CMH184)에서 채취한 샘플로 전장 유전체 시퀀싱(WGS; Whole genome sequencing)을 진행하여, 유전자 질환 증상을 분석(SSAGA; Symptom and sign-assisted genome analysis, 9가지 카테고리로 나뉘어서 591가지 알려진 질병 원인 유전자로 227가지 임상적 증상과 매칭시켜 확인하는 분석방법으로 전문의들의 소견이 반영되어 이루어짐)하였다.

  혈액에서 500ng의 DNA를 추출하여 Covaris S2 Biodisruptor로 파쇄한 후, poly A와 어댑터를 붙여 PCR하였다. RT-PCR로 증폭을 확인 후 라이브러리 제작하였고, HiSeq2500으로 시퀀싱하여 2 x 100bp로 읽었다. 일루미나 시퀀싱 플랫폼으로 엑솜 시퀀싱(Exome sequencing)과 전장 유전체 시퀀싱(WGS; Whole genome sequencing)을 진행하였고 총 3Gb의 결과에서 591가지 열성 질병 유전자를 확인하였다. 시퀀싱 결과는 임상실험 개정안(CLIA; Clinical Laboratory Improvement Amendments) 가이드 라인에 맞춰 진단 검사를 수행하였다. 또 미토콘드리아 유전체 서열의 참조서열로 hg19, GRCH31(NC_012920.1)과 비교, 매핑하여 병인성 유전자를 확인하였다.

  UDT002는 저혈압, 세 가지 발달 회귀가 의심되는 13개월된 남자아이로, 뇌 자기공명영상(MRI)에서 백질이영양증(Leukodystrophy, 수초 구성단백질의 유전적 이상 등에 의해 수초에 발생하는 선택적 장애)이 확인되었다. 150개 백질이영양증 관련 유전자에서 16가지 알려진 병원성 변종 대립유전자의 dbSNP와 일치하는 결과를 보였다. 또한 염색체 상에서 테이샥스병(Tay-Sachs disease, 치명적 뇌손상을 일으키는 유전적 신진대사 병)과 리보좀(Ribosome) 저장 쇠약 장애를 유발하는 A>G 변이를 보였다.

  UDT173은 세 가지 발달 회귀, 저혈압, 발작 증세를 보이는 5개월된 남자아이로, 뇌 자기공명영상(MRI)에서 수초발육부전(Dysmyelination)이 확인되었다. 수초발육부전은 혈청의 구리와 세롤로플라스민(Ceruloplasmin)이 부족하여 나타나는 증상으로, 276개 관련 유전자의 변이에서 유발된다. 그러나 질병을 일으킬 만한 변이가 보고된 바 없었고, 본 연구에서는 후보 유전자로 ATP7A를 선별하여 미스센스 변이(Missense mutation, DNA의 염기서열 중 한 개의 염기가 다른 염기로 치환되어 아미노산의 코돈이 다른 코돈으로 바뀌는 결과를 초래하는 돌연변이)를 일으키는 것으로 추측했다. 유전자에 있던 구리를 운반하는 아데노신 트리포스파테이즈(Adenosine triphospatase)의 탈선 형태로 멘케스 증후군(Menkes’ syndrome, 남자에게 나타나는 반성열성유전질환으로 모발이상, 지능, 신체의 발육지연, 저체온, 중추신경 변성 등의 증상이 나타나는 구리 흡수 장애 질병)을 일으킨다.

  이란성 쌍둥이의 전장 유전체 시퀀싱으로 근육긴장이상은 세피어프테린(Sepiapterin) 환원효소 유전자인 SPR의 변이에 의해 발생한다는 사실을 밝혀냈다. 또한 엑솜 시퀀싱으로는 세포 자살 결핍의 X염색체 억제제에 관련된 XIAP 유전자의 변이를 밝혀냈다.

  이란성 쌍둥이 외에 같은 병원에 있는 비슷한 연령의 신생아들 4명에게도 유전자 분석을 실시하였다. CMH064는 부식성 피부병을 앓는 33주에 태어난 남자아이로, 부모는 건강했으나 아이는 극세포분리증(Acantholysis, 표피세포간의 결합에 관계되는 세포간의 연결의 파괴로 인해서 결합을 잃게 되는 증상)이 있었고, 면역단백질인 IgM, IgA, IgG가 부족하여 손가락, 입술 등에서 부종이 발생하고 혈소판감소성자반병(Thrombocytopenic purpura)과 빈혈이 지속되어 54일만에 사망하였다. 이 아이는 유전자 검사 결과KRT5, DSP, JUP, TP63 그리고 KRT14 엑손 1, 4, 6에서 유전자 변이를 가지고 있었다. 또한GJB2유전자에서 아미노산이 제거되는 프레임 변이로 인해 각막염, 청각 상실 증후군 등이 발견되었다.

  CMH076은 유산 산증, 심근증 그리고 각막이 뿌옇게 35주에 태어난 남자아이로, 마찬가지로 부모는 건강했으나 유산 산증으로 호흡이 곤란했고 심장초음파 검사 시 심장 마비도 왔었다. 또한 소변 검사 시 아미노산은 정상이였으나 메틸글루타코닉산(Methylglutaconic acid), 2-에틸-3-하이드록시 프로피온산(2-ethyl-3-hydroxyl propionic acid)등이 높아 허혈성 뇌증이 우려되었고, 결국 5일만에 사망하였다. 이 아이는 유전자 검사 결과 바스증후군(Barth syndrome, X염색체를 통해 어머니에서 아들에게 질환 유전자의 전달로 생기는, 대사성 및 신경근육성 유전질환)과 관련된 미토콘드리아 이동 RNA에 관련된 75개 유전자 중 TAZ 유전자의 변이가 발견되었다.

 CMH172는 간질 증상을 보이는 39주에 태어난 여자아이로, 가족 중 두 여성 사촌이 중증 지적 장애로 발작이 드물게 나타나는 간질 환자였다. 뇌 척수에 항간질제와 항생제를 투여하는 약물 치료에도 불구하고 발작은 계속되었지만, 혈액의 암모니아, 전해질, 산도, 포도당은 정상이였다. 그러나 폐 협착증 증상을 보여 호흡기 지원을 계속하며 경과를 지켜보던 도중 부모의 지원 철회로 연구가 중단되었다. 유전자 분석 결과는 174개 유전자 중 BRCA1 유전자 관련 단백질의 프레임에 아미노산 삽입을 하여, ATM 유전자가 활성화되는 BRAT1 유전자의 변이가 발견되었다.

 CMH184는 내장이 비정상적 위치에 자리잡고 있고, 선천성 심장 질환을 가진 남자아이로, 동맥관, 비장, 간, 위가 원 위치보다 왼쪽에 있었다. 그의 부모와 두 형제들은 건강했으나, 아이는 X염색체 열성과 관련된ZIC3 유전자의 변이로 현재 심장수술을 진행 중에 있다. 또, 선천성 심장 질환에 관련된 BCL9L 단백질의 변이가 발견되었다.

  BRAT1과 관련하여 신생아에게 치명적인 발작 증후군을 새롭게 식별한 BCL9L 단백질은 HTX6 유전자와 관련 있다. 전장 유전체 시퀀싱 한 신생아에게서 심각한 GJB2 유전자 관련 피부 질환의 진단을 밝히고 부모 또는 형제 자매의 영향을 확인하여, 가능성이 적은 경험적 치료 및 유전자 상담에 빠른 진행을 가능하게 했다.

HiSeq2500 시퀀싱 플랫폼 이용

  임상시험에 의해 식별된 분자 진단으로, 아이들의 DNA 샘플을 전장 유전체 시퀀싱으로 빠르게 분석되었다. 기존보다 샘플 준비에서 4.5~16시간 단축되었고, 어샘블리에서 6시간, 매핑에서 15시간 단축되었을 뿐 아니라 최종 결과 산물에서도 121~139Gb로 41배 증가된 양을 보여주었다. 일루미나 TruSeq와 HiSeq2000시퀀싱을 사용한 엑솜과 CMH-Dx1 방법이 19일이 소요되는 반면, HiSeq2500을 이용하면 50시간 만에 가능하게 되었다.

  CMH064, UDT002, UDT173은 짧은 길이의 게놈 읽어 정렬하는 프로그램 GSNAP(Genomic Short-read Nucleotide Alignment Program)과 게놈 분석 도구 키트GATK(variant caller [the Genome Analysis Tool Kit)를 이용하여 변종을 96% 식별하였다. 여기에 추가적으로 일루미나 BWA와 CASAVA를 이용하여 99.9% 감지하였다.

맺음말

　

 

  이처럼 전장 유전체 시퀀싱은 게놈 의학 및 의료 기술에 많은 영향을 끼치고 있다. 차세대 시퀀싱 기술로 인해 시퀀싱 비용은 신생아 집중 치료(NICU; Neonatal Intensive Care Units)에서 발생하는 비용을 낮추는데 크게 기여 하였다. 또한 유전자 질환의 진단에 HiSeq2500을 사용하여 30시간 내에 연속적으로 140Gb를 생성하도록 하였고, 높은 품질의 서열을 충분한 수량(약 40배)으로 임상테스트에 사용되거나 급성 환자의 치료에 사용할 수 있게 되었다. 이 결과는 HiSeq2000보다 정확도 면에서도 99.5%에서 99.9%로 더욱 높아졌다.

  또한 새로운 후보 질병 유전자의 식별 결과, 첫째는 정보가 부족하여 받지 못했던 유전적 상담을, 둘째는 재발의 위험에 대한 정확한 유전 상담이 가능해졌다. CMH184와 같이 선천성 심장질환과 관련이 예측되는 질병 후보 HTX 유전자와 BCL9L 단백질의 병인성 변이에 초점을 두어, 초기 배아 패턴과 다양한 패턴의 프로세스를 조절하는 Wnt 신호 경로를 확인하였고, 그 결과 HTX를 후보 유전자에서 관련 유전자로 확정 지을 수 있었다. HiSeq2500 기반의 전장 유전체 시퀀싱은 올해 말까지 36시간 내에 수행할 수 있을 것으로 보고되었으나, 임상적인 검증이 남아있어 시간이 조금 더 걸릴 것으로 예상된다.

참고문헌

Rapid Whole-Genome Sequencing for Genetic Disease Diagnosis in Neonatal Intensive Care Units
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23035047
Human genome sequencing in health and disease
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22248320
Treatment for mitochondrial disorders
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16437486

http://www.genome.gov/sequencingcosts/

저자
　

글 : hjpark
편집 : Thkim
글 오류 신고는 hyeonji.park@pgi.re.kr으로 보내주세요.
키워드 : HiSeq2500, Illumina, exome sequencing, whole genome sequencing(WGS), 신생아, 유전자 진단