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비수술적 방법으로 종양의 획득저항성을 추적하다
암은 진화와 선택의 결과로 암 치료에 대하여 저항성을 획득한다. 암 치료 약물의 내성의 원인이 되는 돌연변이 메커니즘 식별하려면, 종양의 이질성과 지속적인 변화를 고려하여, 반복적인 조직검사로 연속 샘플체취를 해야 하는데 종양의 크기가 이미 커진 환자에게선 이 방법이 위험하며, 환자가 동의한다 해도 시간적, 공간적으로 제한이 많은 일이다.
최근의 연구에서는 혈장의 암세포에서 방출되는 종양 DNA의 대규모 병렬염기 서열을 시행하는, 비 수술적인 혈액 생검방법을 사용하여 고체 암의 특성에 따른 게놈의 변화를 볼 수 있다. 이 연구에서는 암의 치료에 따른 암에서의 게놈 진화(획득저항성)를 추적하기 위하여, 엑솜 시퀀싱을 수행하였다.
순환종양DNA의 엑솜 시퀀싱 적용과 혈액 속 암세포 추적기술 개발
(종양에서 떨어져 나와 혈관 속을 떠도는 순환종양세포(CTC: circulating tumor cell)을 추적할 수 있는 '혈액생검'기술)
최근에는 혈액 생검으로 채취된 혈장의 DNA 시퀀싱 방법을 사용하여 암 환자의 혈관 속을 떠도는 순환종양세포(CTCs)를 추적하는 방법을 쓰고 있다. 이러한 연구는 혈장 DNA의 여러 개의 독립적인 종양에서 발생하는 변형을 함께 혼합하여 전체 종양의 게놈의 표현을 검색하는 방법이다. 또한 혈액 속의 높은 종양수로 선택된 샘플에 대하여 시퀀싱을 수행하여 종양의 클론변화에 대하여 조사 할 수 있다. 본 연구에서는 전신의 암 치료 과정 동안의 종양 진화의 비 수술적인 분석을 위한 플랫폼으로 ctDNA의 엑솜 시퀀싱을 적용했다.
샘플정보 및 분석과정
폐암 1-5번 샘플은 영국 캠브리지의 Addenbrooke 병원에서 윤리위원회에 의해 승인된 샘플로 임상 연구로 모집되었다. 6번 샘플의 폐암환자의 경우, NHG 국립 의료 그룹에 의해 승인된 국립 대학 건강 시스템에 연구 '폐암 치료에 Hydroxychloroquine 및 gefitinib(게피티닙)약물 사용' 의 임상연구의 한 부분으로 싱가포르에서 모집되었다.
후기 유방암, 난소암, 폐암을 가진 여섯 명의 환자를 1-2년 동안 추적 관찰하여 각각의 경우에 대하여, 변이 대립유전자 비율을 보고, 향상된 감도를 보이는 변이를 찾기 위하여, 수주 간격으로 혈액을 채취 하였고, 혈장분리 뒤 DNA의 염기서열을 추출하였다. HiSeq2500(Illumina) 차세대 시퀀싱으로 1:1 비율로 풀링했다.
변이 콜링 및 분석방법에서 시퀀싱 데이터는 다중화 및 BWA를 사용하여 hg19로 게놈 정렬 하였다. 다중 충돌 파일의 경우 매핑의 품질을 높이기 위해 SAMtool을 사용하여 생성하였고, AF(allele fraction)들은 모든 Q30베이스에 대해 계산 한 뒤, Bonferroni 보정법을 거쳐 다시 수정되었다. Bonferroni 보정법이란, 독립적인 여러 귀무가설을 테스트할 때 유의수준을 보정하는 방법을 말한다. 환자의 혈장 비교를 위해 관찰된 AF의 취득 이항 확률을 계산하였다. 수정 된 게놈 전체의 집계 대립 손실을 혈장 종양 부하(돌연변이 대립유전자가 표준보다 부하되는 정도)를 사용하여, 샘플간에 일정하게 유지 하였다.
치료에 관련된 변이 식별과 종양의 게놈 진화 증거
후기 암을 가진 암환자에서 치료 전과 진행 동안의 시간의 변화를 주어 혈장을 수집하였다. 치료 전의 샘플과 비교하였을 때, 치료 중의 샘플에서는 변이의 비율이 낮았다. 특정 치료에서의 내성이 발생할 때에 상당한 비율의 증가를 보인 변이를 식별하여, <내성과 관련하여 증가된 변이의 목록>을 생성하였다. 이 목록에는 종양의 성장과 약물 저항을 촉진하는 것으로 알려진 변이뿐만 아니라, 알 수 없는 의미를 가진 변이도 포함하였다. 대규모 코호트(Cohort)를 통하여 이러한 데이터를 축적하는 것은 반복 변이의 유전자와 경로를 확인하는 것에 도움이 된다.
후기 암을 가진 6명의 환자(유방암2명, 난소암 3명, 폐암1명)에서 혈장 DNA의 전체 엑솜 시퀀싱(whole exome sequencing)을 수행하였다. 665일 동안의 치료기간에 걸쳐 연속적으로 채취된 여러 혈장에서 수행되었다. 게놈의 변화를 감지하는 능력은 분석 샘플의 돌연변이 대립유전자 비율, 시퀀싱 수준, background noise 의 비율에 따라 달라진다. 샘플당 시퀀싱을 31~160배수로 하였다. 전체 게놈에 걸쳐 모든 환자의 혈장샘플에서 CNA(재발가능표지자, copy number aberrations)수를 관찰한 결과, CNA수는 혈장 종양 DNA의 비율에 의해 강하게 변화되어 있었고 변이 AF가 50 %를 초과하는 혈장 샘플에서 특히 현저했다.
혈장 또는 전이성 종양의 생검에서 데이터를 배열에서 확인 된 돌연변이를 비교한 결과, CNA (재발가능표지자)는 환자 모두에게서 혈장 및 전이성 종양 DNA 사이의 일치율을 보였다. 종양의 돌연변이의 프로파일 변화를 파악하기 위하여, 각 치료 과정에서의 혈장에서 발견된 체세포 변이와의 충분한 비교 후, 본페로니 검증법을 거쳐 오차율을 제외시켜 정확한 목록을 조사할 수 있었다. 그 결과 유방암 케이스 1에서는 'paclitaxel'약물로 처리한 후 활성화 변이의 존재가 관찰되었다. 변이는 유방 상피 세포에서 'paclitaxel(파클리탁셀, 항암제)'에 대한 내성을 촉진하는 역할을 했다.
유방암 케이스 2에서는 'trastuzumab'와 'tamoxifen(타목시펜, 유방암 치료 및 예방약)'약물로 치료한 후 카르복시 말단 부근에서 nonsense mutation의 증가로 이어져 내성에 관여된다고 판단되었다. 'capecitabine(카페시타빈, 재발성/전이성 유방암, 췌장암 치료제)'와 함께 'lapatinib' 약물로 치료 후, 티로신 키나제 수용체 AXL의 리간드(ligand) GAS6(growth arrest-specific 6)유전자의 접합 변이량의 증가가 관찰되었다. AXL kinase 경로의 활성화는 NSCLC의 ' tyrosine kinase receptor(티로신인산화 효소수용체)'에 대한 내성 및 ER(에스트로겐 수용체)양성, HER2 양성 유방암(유방암 중 HER2양성반응을 가진 것으로, HER2 단백질의 비정상적인 증가를 보임) 세포에서 'lapatinib(라파티닙, 유방암치료제)'에 대한 저항성을 일으키는 것으로 나타났다.
난소암 케이스의 경우 ' cisplatin(시스플라틴, 난소암, 고환암, 전립선암 등의 암 치료제)' 처리한 후 종양억제 RB1에서 돌연변이양의 증가가 관찰되었고 이로 인하여 단백질이 불활성화 될 것으로 예상하였다. 케이스 6은 'gefitinib(게피티닙, 폐암치료제)'에 의해 처리 된 EGFR의 활성화 변이를 가진 NSCLC(비소세포폐암, Non-Small Cell Lung Cancer) 환자였다. 디지털 PCR에 의한 분석은 진행이 아니라, 치료 시작 시 혈장에서 EGFR(T790M) 변이를 발견했다. 이 변이는 'gefitinib'에 결합을 억제하는 획득 내성을 가진다.
맺음말
치료 중에 일어나는 게놈의 변화 중 내성 관련 변이의 식별 선택을 위하여 혈장 DNA 엑솜시퀀싱 하여 분석하였다. 혈장 ctDNA의 엑솜 분석의 비 수술적인 생검의 방식을 사용하여 새로운 사례를 나타냈다는 것이 주목할 만한 점이다. 이 연구에서의 데이터는 CNA와 ctDNA에서 확인 된 체세포 변이가 종양의 게놈의 대표적인 변이이고, 기존의 반복적인 생검의 한계를 극복할 수 있는 새로운 대체방법을 제공한다.
이것은 종양크기나 핫 스팟 변이영역 분석을 위한 바이오 마커로, ctDNA 사용을 위한 케이스를 강화뿐만 아니라, 종양의 이질성과 클론진화를 식별하여 다른 변이를 추적하는 데에도 도움을 준다. 이번 연구 데이터로 인하여, 암 치료 이후의 강한 약제내성과 관련 있는 것으로 추정되는 유전자의 일부를 발견하였으며, 다수의 이러한 통계 데이터를 축적하여 특정 치료의 종류에 따라 수시로 변화하는 새로운 유전자 및 경로를 파악하고 분석하는 데에 도움이 될 수 있을 것이다. 취득한 약제 내성 분석은 거의 모든 초기 단계의 진행성 또는 전이성 암의 임상시험에 특히 유용하게 쓰일 수 있다. 혈장의 암 엑솜 분석의 비수술적 방법은 치료 반응에 대한 내성과 연관된 클론 복제진화의 상세하고 포괄적인 평가를 가능하게 하고 높은 조직종양크기의 환자에게 쉽게 적용이 가능하다.
참고문헌
Non-invasive analysis of acquired resistance to cancer therapy by sequencing of plasma DNA
저자
글 : Jung.EunByoul
편집 : Park.HyeonJi
키워드 : 순환종양세포(CTC : circulating tumor cell), ctDNA, exome sequencing, HiSeq2500(Illumina), CNA(재발가능표지자, copy number aberrations) 등
