NGS를 이용한 후추(Piper nigrum L.) 전사체 해독

  후추(Piper nigrum L.)는 세계에서 가장 인기 있는 향신료 중 하나로 요리와 음식의 보존에도 사용되며, 심지어 의약품으로도 사용되고 있다. 의약품으로 이용되는 후추의 항산화 기능에 이어 최근 발표된 논문에 의하면, 항염증 및 항암제의 특성도 가지고 있다고 하여, 2009년 미국의 가치 측정결과 약 10억에 가까운 결과를 낳기도 하였다. 이런 후추도 인삼 근부병균(Fusarium solani)과 역병균(Phytophtora capsici)에 의한 감염으로 생산에 손실을 입고 있어서 농가의 걱정이 날로 커지고 있다. 이에 브라질 대학 연구진들이 병원체와 숙주의 분자 상호 작용을 이해하여 번식을 방지하는 메커니즘을 밝히기 위해 RNA sequencing을 연구하였다.

Piper nigrum L.

　

  후추 종의 하나인 Piper nigrum L.는 인도 남서부 지역의 다년생 식물로 열대지역에서 자생하는 종이다. 현재까지는 해충 및 질병으로 인한 후추의 생산량 손실이 많음에도 불구하고 유전적 지식이 부족한 실정이다. 이에 연구진들이 일루미나 차세대 시퀀싱 플랫폼(Illumina)을 이용하여 전사체를 시퀀싱하였다.

  차세대 시퀀싱(NGS; Next Generation Sequencing) 기술을 이용하여 후추의 게놈 및 다형성의 전사체 특성을 식별하고, 이를 이용하여 식물의 전사체를 더 깊이, 높은 처리량으로 연구하였다. 전사체의 RNA-seq 분석으로 Magnoliid 목 > Piperaceae 과 > angiosperms 속으로 후추를 계통분류하였다(계통분류에는 P.nigrum의 contig와 P.trichocarpa의 mRNA 유사성을 이용하여 96% 유사한 CDS(Complete Coding Sequences, 완성된 암호 서열)를 참조서열로 사용).

후추의 전사체 분석

　

  Piper nigrum L. (브라질의 개량 품종; Uthirankottadhk Cheriyakaniyakadan cultivars 교잡)의 뿌리에서 샘플을 추출하였다. RNA는 Illustra RNAspin Mini Kit (GE Healthcare, USA)를 이용하여 추출하였고, Oligotex Direct mRNA Mini Kit (Quiagen, USA)를 이용하여 DNA를 제거하였다. 높은 처리량의 시퀀싱을 하기 위해 cDNA 라이브러리를 SOLiD Total RNA-Seq Kit (Invitrogen, USA)를 이용하여 만들었다.

  시퀀싱 결과는 PlantGDB, NCBI의 레퍼런스(V.vinifera, A.thaliana, P.trichocarpa, G.max and O. sativa)와 비교하였고 Velvet과 Oases를 이용하여 어셈블리 하였다. 그 다음 일루미나 시퀀싱 플랫폼에 맞춰 BWA로 시퀀스를 읽고 정렬하였다. 매핑된 시퀀스는 5x로 100bp씩 읽어서 전사체의 SSR(Simple Sequence Repeats)에 대한 반복서열을 감지하였다.

  rRNA 분석 결과 SeqClean으로 필터링하여 Aristolochia fimbriata(프린지 더치맨파이프, 농작물을 감염시키는 병인균 단백질 ; 3.8Mb)의 프로테옴이 발견되었다. Aristolochia fimbriata는 후추 전체 시퀀스의 44%를 차지하는 암호화된 시퀀스부위와 유사한 시퀀스를 지닌 Arabidopsis thaliana(애기장대)를 감염시킬 뿐만 아니라 다른 식물인 Vitis vinifera(비티스 비니페라; 포도나무 품종 중 하나),Populus trichocarpa(카보네라 크리크; 검은시나무)에서도 발견되는 종이다.

  후추의 염색체는 사배체(tetraploid, 2n=52)라서, 전사체 양을 추정하는 것이 복잡했다. 세포 유전자 연구에 의해 추정된 유전체 크기는 애기 장대보다 10배 큰1,220Mb으로 확인되었다.

맺음말

　

  생명공학적 방법이 식물의 번식에 이용되어 병원균에 대한 저항을 증가시킬 수 있게 되었다. 이를 이용하기 위해 유전자를 분리하여 유전형과 표현형의 특성화가 선행되어야 한다. 전체 게놈을 시퀀싱하는 대신 전사체 만을 시퀀싱하면 신속하고 효율적으로 유전자의 표현형 특징을 알 수 있었다. 데이터가 적은 후추의 게놈은 앞으로 다양한 후추의 계통 분류에 이용될 것이고, 향신료 산업의 경제적으로 중요성을 가지게 되었다.



참고문헌

High-throughput sequencing of black pepper root transcriptome
http://www.biomedcentral.com/1471-2229/12/168
FASTQC, a quality control tool for the high throughput sequence data
http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/%5d
Oases: Robust de novo RNA-seq assembly across the dynamic range of expression levels.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmc3324515/

저자

　

글 : hjpark
편집 : Thkim
글 오류 신고는 hyeonji.park@pgi.re.kr으로 보내주세요.
키워드 : black pepper, piper nigrum, 인삼 근부병균(Fusarium solani), 역병균(Phytophtora capsici), RNA sequencing, transcriptome, Magnoliid, Piperaceae, angiosperms, P.trichocarpa, Uthirankottadhk Cheriyakaniyakadan cultivars, Aristolochia fimbriata(프린지 더치맨파이프)